Медицинская литература

Вирусы гриппа и грипп

Раздел: Медицина 

Д. БУКЕР и П. ПАЛЕЙЗИ (BUCHER, P. PALESE)

I. ВВЕДЕНИЕ

Существование нейраминидазы впервые предположил в ставшей в настоящее время уже классической работе Hirst (1942). Он обнаружил, что если агглютинировавшие в присутствии ъируса гриппа эритроциты деагглютинировать, то при добавлении к ним 'нового вируса они вновь не способны к агглютинации. При этом, однако, элюированный вирус не теряет своей способности агглютинировать свежие эритроциты. Неизвестная субстанция изменяла свойства поверхности красных кровяных телец. Прозорливое предположение Hirst о том, что на поверхности вириона должен функционировать какой-то фермент, не соответствовало распространенной в то время точке зрения, согласно которой вирусы отличаются от бактерий в основном тем, что в их составе ферменты полностью отсутствуют.

Примерно до середины 60-х годов яе было известно, функционирует -ли нейраминидаза отдельно от гемагглютинина и является ли она самостоятельным белком. Hirst (1942) предположил, что явление гемагглютинации отражает связывание фермента с субстратом и оба явления — агглютинация и элю-ция — могут 'быть объяснены существованием одного фермента. Hirst (1942) указал на сходство рассматриваемой реакции с реакцией фермент — субстрат. Предполагалось, что образование промежуточного продукта 'взаимодействия фермента с субстратом, так 'Называемого фермент-субстратного комплекса, эквивалентно реакции гемагглютинации. После химической модификации субстрата фермент-субстратный комплекс распадается, и фермент восстанавливает способность адсорбироваться на новых молекулах субстрата и менять их химическую структуру. Hirst предположил, что понятию «субстрат» в реакции гемагглютинации соответствует некое вещество на шоверхности рецепторов эритроцитов и что оно  разрушается в результате     реакции    гемагглютинации.

Позднее Burnet (1951) подтвердил, что ферментативные и ге-матглютинирующие центры 'вириона идентичны.

После отделения нейрамияидазы от гемагглютинина, сначала с помощью протеолитического фермента трипсина (Мау-ron et al., 1961; Noll et al., 1962), а затем с помощью детергентов, таких, как SDS (Laver, 1963), стало ясно, что эти два компонента вириона являются индивидуальными белками. Однако абсолютное доказательство этого утверждения было дано после того, как стало возможным отделить индивидуальные в антигенном смысле нейраминидазу и гемагглю-тинин в опытах ло генетической рекомбинации и доказать их биохимическое и антигенное различие (Laver, Kilbourne, 1966). Ada и Lind (1961) предположили, что нейраминидаза может быть ферментом клетки-хозяина, включенным в ви-рион, .поскольку неинфицированные «летки куриных эмбрионов обладали нейраминидазной активностью, а аятисыворот-,ка к нейраминидазе вируса, выращенного in ovo, ингибиро-вала яейраминидазную активность клеток куриного эмбриона. Однако более -поздние работы показали, что хотя вирусный фермент антигенно сходен с ферментом системы, где вирус репродуцировался (in ovo или в клетках почек теленка), 'кросе-реажции между клеточной нейраминидазой и нейраминидазой вируса, вероятно, определяются наличием у этих ферментов общих детерминантов углеводной природы (Ada et al., 1963).

II. СПЕЦИФИЧНОСТЬ НЕЙРАМИНИДАЗЫ

Gottschalk (1957), Blix и соавт. (1957) установили, что фермент, входящий в состав вирионов гриппа, гидролизует гликозидную связь, соединяющую кетогруппу N-ацетилнейр-аминовой кислоты (NANA) с Ь-галактозой, D-галактозами-ном или, возможно, с другими сахарами. За ферментом утвердилось название «нейраминидаза» — NA (Gottschalk, 1957). Кроме того, для обозначения фермента часто употребляется термин «сиалидаза». Эти названия являются отражением того, что фермент отщепляет вещество, которое называют либо нейраминовой, либо сиаловой кислотой (Heimer, Meyer, 1956). Номенклатурное название нейраминидазы, согласно «Номенклатуре ферментов» (1965),—мукополисаха-рид Ы-ацетилнейраминилгидролаза, ЕС 3.2.1.18. Фермент гидролизует связь между терминальной сиаловой кислотой и соединенной с ней с помощью а-связи молекулой сахара. Обзоры работ по изучению свойств бактериальных и вирусных нейраминидаз были опубликованы Drzeniek (1972, 1973), а также Gottschalk и Drzeniek (1972).

В природных нейраминовых .кислотах аминогруппа при углеродном атоме Cs всегда замещена на N-ацетил- или на

N-гликолильную группу, а гидраксильная группа (группы) иногда О-ацетилирована (Blix et al., 1957; Gottschalk, 1960). О-ацетильные группы замещают тидроксилы в положении 4, 7 или 8 и легко отщепляются после обработки разбавленными щелочами или кислотами. У большинства животных N-ацетил- и N-гликолилнейраминовые кислоты существуют в одно и то же время, причем отношение их содержания различно для разных видов животных и для разных тканей и секреторных выделений в случае одного вида (Gottschalk,. I960). Специфичность нейраминидазы зависит от вида заместителя при атоме азота в сиаловой кислоте субстрата; N-ацетильная форма расщепляется нейраминидазой вируса гриппа с гораздо большей скоростью, чем N-гликолилнейр-аминовая кислота (Flockton, Hobson, 1970). Было показано,, иго нейраминидаза вируса гриппа является высокоспецифичным ферментом и что ее специфичность отличается от специфичности бактериальных нейраминидаз (Drzeniek, 1972). Используя синтетические производные нейраминовых кислот, Meindl и Тирру (1966а) показали, что для того, чтобы гид-ролизовать субстрат с помощью нейраминидазы, абсолютно необходимо присутствие свободной карбоксильной группы. Замещение N-ацетильной группы более объемными группами, такими, как бензоильная, бутильная или бензилоксикарбо-нильная, превращает нейраминсодержащий субстрат в устойчивое соединение для гидролиза бактериальными нейрами-нидазами (Meindl, Tuppy, 1966; Faillard et al., 1969). Чувствительность субстратов к гидролизу вирусными нейрамини-дазами значительно снижается после окислительного отщепления от молекулы нейраминовой .кислоты углеродного атома Сэ или атомов Cs и Сд. Это указывает на высокую структурную специфичность действия нейраминидазы (Suttajit, Winz-ler, 1971).

Природа связи нейраминовой кислоты с углеводной частью (агликогон) также важна для специфичности действия нейраминидазы. Основываясь на результатах, полученных с использованием природных субстратов, в большинстве которых нейраминовая кислота связана с агликоном а-евязью, был сделан вывод, что нейраминидаза расщепляет только а-связи (Gottschalk, 1957, 1958; Kuhn, Brossmer, 1958). Используя синтетические субстраты, Meindl и Tuppy (1966a, b) показали, что фермент не отщепляет нейраминовые кислоты, присоединенные к агликону (З-связью. Строение атлвкояа, по-видимому, не играет существенной роли (Schauer, Faillard, 1968).

Углеродный атом С2 нейраминовой кислоты может быть соединен с углеродными атомами С3, С6 и, возможно, С4 галактозы, углеродным атомом С6 N-ацетилгалактозамина, углеродным атомом С6 ацетил^-глюкозамина или с Cg другой

молекулы нейраминовой кислоты (Drzeniek, 1973). Нейрами-новая .кислота всегда находится на конце цепи, если она не присоединена к другой молекуле нейраминовой кислоты связью (а, 2—*8) (Gottschalk, Drzeniek, 1972). Бактериальные нейраминидазы действуют преимущественно на а-кето-зидные связи, такие, как (а, 2—*3), (а, 2—>~4), ,а, 2——иб) и (а, 2—->-8), а вирусные нейраминидазы, такие, например, как нейраминидаза вируса болезни Ньюкасла и вируса чумы птиц (FPV), в основном гидролизуют связи 2—ьЗ (Drzeniek, 1967, 1972, 1973). Обе эти вирусные нейраминидазы относительно неактивны в отношении связей 2—Иг и 2—йЗ (Drzeniek, 1967; Huang, Orlich, 1972), а связь 2—>-8 расщепляет нейраминидаза FPV (Drzeniek, Gauhe, 1970).

III. СУБСТРАТЫ ДЛЯ НЕЙРАМИНИДАЗЫ

А. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ N-АЦЕТИЛНЕЙРАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Метод, который обычно используют при определении концентрации нейраминовой .кислоты, включает образование окрашенного соединения при добавлении тиобарбитуровой кислоты. Он был разработан Warren (1959, 1963) и модифицирован Aminoff (1959, 1961). Метод позволяет измерять концентрацию свободной «ейраминовой кислоты в присутствии связанной ацетилнейраминовой кислоты. Если выход окрашенного продукта при определении концентрации N-ацетил-нейра-миновой кислоты принять за 100%, то его выход при проведении реакции с производными нейраминовой кислоты будет составлять: для N-гл'Иколилнейраминовой кислоты — 63%, М-ацетил-4-0-а|цетилнейрам|Иновой кислоты—100%, N-ацетил-8-О-ацетилнейрам'ИНовой кислоты — 47% и N-ацетил-7-О-ацетилнейраминовой кислоты — 0%   (Drzeniek,   1972).

Б. ПРИРОДНЫЕ СУБСТРАТЫ

Нейраминидаза уникальна по своей способности взаимодействовать с субстратами самых различных размеров (Ci-nader, 1967) —от сиалиллактозы с относительной молекулярной массой (ОММ) 633 до овомукоида (ОММ 44 000) и от фетуина (ОММ 48400) до чгдикопротеида, выделенного из мочи (ОММ 7-Ю6).

Все субстраты можно разбить иа две группы — высокомолекулярные и низкомолекулярные. Низкомолекулярные природные субстраты охарактеризованы полнее и, вероятно, ограничиваются лишь одним примером:   N-ацетилнейраминилла'ктозой

или сиалиллактозой (17). N-ацетилнейраминиллактозу впервые изолировали из молозива крупного рогатого скота (Kuhn, Brossmer, 1958). Она содержала около 8—14% а, 2—>~6) связей и около 72% связей типа (а, 2—>-3) (Sehneir, Rafelson, 1966; Ohman, Hygstedt, 1968). Молекулы со связью типа (л, 2—хб) могут быть отделены от молекул со связью (а,2—>-3) с помощью ионообменной хроматографии по методу, описанному Sehneir и Ralelson (1966). В идеальном случае в качестве субстрата для нейраминидазы вируса гриппа должна быть использована N-ацетилнейраминиллактоза типа (а, 2—>-3), однако обычно для этой цели используют смесь изомеров двух типов. В качестве субстрата для нейраминидазы, «роме того, используют низкомолекулярные синтетические соединения, свойства которых будут описаны далее.

В природе существует много высокомолекулярных соединений, содержащих сиаловые кислоты. При определении пригодности субстрата для проведения количественного определения нейраминидазы вируса гриппа необходимо знать гомогенность и чистоту субстрата. Имеет значение тип сиа-ловой кислоты (например, N-ацетил-, N-гликозил- или O.N-диацетилнейраминовая кислота), содержащейся в субстрате. Пригодность вещества для работы с вирусными нейрамини-дазами определяется также тем, какой вид связи: '(а, 2—>-3), (а, 2—>-8) или (а, 2—*8) существует между нейраминовой кислотой и агликоном. Ранее в качестве субстратов использовали большое число гликопротеидов, содержащих опаловую кислоту, но только немногие из них были охарактеризованы с биохимической точки зрения.

Фетуин, аг-гликопротеид эмбриональной сыворотки теленка, является наиболее распространенным субстратом, впервые использованным в тестах на вирусную нейраминидазу. Spiro (1960) выделил фетуин из эмбриональной сыворотки теленка с выходом 17% от общего содержания белков сыворотки. Сиаловая кислота составляет 8,7% общей массы полипептида, относительная молекулярная    масса    которого

равна 48 400. Сиаловая кислота находится в основном в N-ацетильной форме с содержанием N-гликолилнейрамино-вой кислоты 7% от общего количества сиаловой .кислоты. Условия для определения иейраминидазы с использованием фе-туина в качестве субстрата были стандартизированы для об-наоужения нейраминидазных антител (Aymard-Henry et al., 1973).

В качестве нейраминидазного субстрата часто используют также муцины из подчелюстных желез. Содержание N-гли-колил- или N-ацетилнейраминовой .кислоты (варьирует в зависимости от источника выделения муцина (Gottschalk et al., 1972). Например, муцин, выделенный из подчелюстной железы овцы, содержит в основном N-ацетилнейраминовую -кислоту, в состав муцина, выделенного из подчелюстной железы свиньи, входит преимущественно N-гликолилнейраминовая кислота, а в состав бычьего муцина входит как N-глнколил, так и N-ацетилнейраминовая .кислота. Поскольку нейрами-нидаза вируса гриппа расщепляет N-ацетильную форму нейр-аминовой кислоты с большей эффективностью, чем N-глико-лильную форму (см. раздел II), лучшим субстратом можно считать муцин, выделенный из подчелюстных желез овцы. Мукоид ласточек (рода Collocalia), выделенный из съедобных птичьих гнезд, предложили в качестве субстрата для нейраминидазы Howe и соавт. (1961). Нейраминовая кислота составляет приблизительно 9—13% массы мукоида. Однако большое число ацетогрупп нейраминовой кислоты присутствует в нем не в N-ацетильной, а в О-ацетильной форме (Ка-than, Weeks, 1969). В качестве субстрата для нейраминидазы вируса гриппа использовали также орозомукоид—си-кислый гликопротеид сыворотки человека  (Rafelson et al.,  1963a).

При сравнении скоростей отщепления N-ацетилнейраминовой кислоты от некоторых (высокомолекулярных субстратов Rafelson и соавт. (1963а) определили, что если принять количество NANA, отщепляемого от сиалиллактозы, за 100%, то от мукоида Collocalia отщепилось 26%, от гаптоглобина 1-1—23%, от гаптоглобина 2-2 — 22%, от орозомукоида — 17%, от ингибитора, изолированного из стром эритроцитов,— 10%, от гликопротеида мочи — 5% N-ацетилнейраминовой кислоты. Однако, хотя и имеется большое различие в скоростях отщепления, абсолютное количество отщепляемой за достаточное время от указанных субстратов нейраминовой кислоты менялось в пределах 58—85%, если за 100% принять отщепление от сиалиллактозы.

Совсем мало известно о реальных субстратах, подверженных действию нейраминидазы во время репликации вируса гриппа in vivo. Известно, что нейряминидаза отщепляет нейраминовую кислоту от поверхностного рецептора эритроцитов при элюции с них вирионов гриппа. Этот рецелторный

белок — гликопротеид с относительной молекулярной массой около 31000 — был выделен в чистом виде и обладал М- и N-группоспецифической активностью крови (Kathan, Winzler,. 1963; Winzler, 1972). Аналогичные гликопротеиды других клеточных мембран не были изучены так же подробно.

В. СИНТЕТИЧЕСКИЕ СУБСТРАТЫ

Большое 'количество синтетических субстратов для нейраминидазы было получено с помощью присоединения ароматических и алифатических спиртов к С2 углеродному атому различных производных нейраминовой .кислоты (Tuppy, Gottschalk, 1972). ЭТИ синтетические субстраты можно приготовить с высокой степенью чистоты. Они могут помочь в понимании механизма специфичности различных нейраминидаз. Meindl и Tuppy (1967) предложили использовать в качестве удобного кристаллического субстрата для нейраминидазы фенилкетозид N-ацетилнейраминовой кислоты: 2-фенил-^ ацетилнейраминовую кислоту. Отщепляемый в этом случае фенол определяли с помощью фенольной реакции Фолина. И. М. Привалова и А. Я- Хорлин (1969) описали синтез 2-р-нитрофенил-^ацетилнейраминовой кислоты, которую также можно использовать в качестве удобного субстрата для нейраминидазы. Подобный субстрат — 2-(О/-метоксифенил)-г\1-ацетилнейраминовая кислота (МФН) (Tuppy, Palese, 1969) можно успешно применять в качестве субстрата с использованием фенольной реакции Фолина (Palese et al., 1973). Другую методику использования МФН в качестве субстрата описали Sedmak и Grossberg (1973). После ферментативного отщепления МФН отщепленный 3-метоксифенол (МФ) определяют как солюбилизированный комплекс диазониевой соли с МФ. Белок в высокой концентрации мешает определению* свободного фенола по методу Фолина (Palese et al., 1973), но не играет роли в МФ-диазониевом методе (Sedmak, Gross-berg, 1973), что позволяет проводить определение нейрами-нидазной активности тотальных вирусных препаратов. МФН также использовали для обнаружения нейраминидазной активности в полиакриламидных гелях и целлюлозоацетатных пластинах (Tuppy, Palese, 1969; Bucher, Kjlbourne, 1972), а также для окраски бляшек вирусов, содержащих нейрами-нидазу (Palese et al., 1970, 1973). Для обнаружения вируса с помощью метода бляшек в монослой клеток вводят вирус гриппа или парагриппа, и на монослой наносят слой агара. После необходимой инкубации добавляют субстрат и диазо-ниевую соль 4-амино-2,5-диметоксинитразобензола, которые диффундируют сквозь агар. В местах репликации вируса субстрат гидролизуется и образует с диазониевой солью нерастворимый продукт красного цвета (18). Из этих фокусов может быть изолирован инфекционный вирус.

Недавно был синтезирован флюоресцирующий субстрат для нейраминидазы — 4-1метилилум'беллиферрил-Г\[-ацетил-нейраминовая кислота (Palese, неопубликованные данные). Субстрат позволяет -быстро и с высокой чувствительностью определить нейраминидазную активность. Разработка такого рода субстратов должна облегчить исследование по изучению свойств нейраминидазы, а также помочь в разработке методов ее выделения и количественного определения. Конфигурация этих субстратов может помочь в дальнейших исследованиях природы активного центра фермента.

IV. ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НЕЙРАМИНИДАЗЫ

А. КОНСТАНТА МИХАЭЛИСА

Константа Михаэлиса (Км) отражает степень сродства фермента к субстрату и является параметром, который можно использовать для сравнения нейраминидаз, выделенных из различных штаммов. Величины Км для различных штаммов вируса     гриппа  при  использовании  в     качестве    субстрата М-ацетилсиалилла.ктозы (а, 2—>~3) равны: PR8 (N1) Км = = 1,0-Ю-3 М, оптимум рН 7,0; А2 (Япония)/305/57 (N2) Км = = 2,0-Ю-4 М, оптимум рН 6,5; FPV Км = 4,0-10^4 М, оптимум рН 6,0; B/Lee Км = 2,0-10~4 М, оптимум рН 6,8; данные суммированы в работе Gottschalk и Drzeniek (1972). Как величина Км, так и оптимальное значение рН являются субстрат-зависимыми величинами.

Используя синтетический субстрат МФН при рН 5,8, Sed-mak и Grossberg (1973) нашли, что величина Км для нейраминидазы штамма A0/NWS/39 (N1) равна 3,5 ■ 10—3 М, а для нейраминидазы, выделенной из A2/R 15+/57, Х7 и X7(F1) (N2), эта величина равна 6,5—6,9• 10~4 М, что указывает на пятикратное различие в сродстве к субстрату этих двух типов нейраминидаз. Как для сиалиллактозы, так и для МФН нейраминидаза типа N2 имеет в 5 раз большее сродство к субстрату, чем нейраминидаза типа N1. Однако абсолютное сродство Км обоих типов нейраминидаз к сиаллактозе в 3 раза ъыше, чем к МФН.

Б. ОПТИМУМ рН

Оптимальное для  работы  нейраминидазы вируса  гриппа значение рН зависит от штамма вируса и используемого субстрата. В отличие от кислых значений рН, оптимальных для нейраминидаз бактерий и млекопитающих, аналогичные значения  для  нейраминидазы  вируса  гриппа  обычно  сдвинуты в щелочную сторону и более близки к нейтральным значениям рН. Kendal и Madeley  (1969), используя в качестве субстрата сиалиллактозу, иашли, что для (большого числа штаммов  вируса   грдоша,  включая   штаммы   вирусов   гриппа   АО, A1(N1), A2(N2), В, а также вируса А птичьего происхождения,  оптимум  рН  лежит  в  пределах  6,4—7,0.  Оптимальное значение рН  зависит также от вида связи,     расщепляемой ферментом. Schneir и Rafelson  (1966)  определили, что нейраминидаза   (N2)   расщепляет    химическую    связь   (а, 2—>-3) с максимальной скоростью гари рН 6,5, в то время как та же нейраминидаза для расщепления связи  (а, 2—>-6)   имеет оптимальное значение рН 4,5.  Однако максимальная скорость расщепления   (а, 2—>-6)  N-ацетилсиалиллактозы    составляла, только 6%   от аналогичной скорости для   (а, 2—>-3)   формы субстрата.

В. ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОДУКТОМ РЕАКЦИИ

Нейраминидаза вируса гриппа 'конкурентно ингибируется. продуктом нейраминидазной реакции — N-ацетилнейрамино-вой кислотой, хотя для этого требуются относительно высокие концентрации нейраминовой    кислоты.    Walop и соавт. (1960), используя в качестве субстрата сиалиллактозу, определили Ки = 5,0-10-3 М для нейраминидазы штамма A2/57/Sing (N2). Rafelson и соавт. (1963b) для штамма PR8 (N1) определили Ки = 2-10^2 М и Ки=4-10-3 М для азиатского штамма при опти-мумах рН 7,0 и 6,5 соответственно. Это означает, что сродство нейраминидазы N2 к продукту реакции в 5 раз выше, чем аналогичная величина для нейраминидазы N1. Такое же соотношение существует между сродством Км нейраминидазы N2 н Ki к субстрату ферментативной реакции.

Г. ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ И ПОТРЕБНОСТЬ В ИОНАХ КАЛЬЦИЯ

Хотя эти два свойства на первый взгляд кажутся совершенно независимыми, появляется все больше фактов, указывающих на их связь. Burnet и Stone (1947) показали, что нейраминидаза Vibrio cholerae имеет температуру инактивации на 8°С выше в (Присутствии ионов 2+Са, чехМ в их отсутствие. Сходный эффект был продемонстрирован для нейраминидазы вируса гриппа штамма B/Lee. Boschman и Jacobs (1965) обнаружили, что нейраминидаза штаммов FMl(Nl), А2 Япония (N2) и B/Joh резко повышают свою температурную чувствительность после обработки ЭДТА. Было, "кроме того, показано, что термостабильность и потребность в ионах .кальция меняются от штамма к штамму (Boschman, Jacobs, 1965; Dimmock, 1971). Нейраминидаза штамма АО(WSN) (N1) полностью теряет свою активность после прогрева в отсутствие Са2+ (Dimmock, 1971). Если же в растворе имелись Са2+, то 35% активности сохранялось. Ионы магния не могут заменить Са2+ для получения эффекта стабилизации. Действие Са2+ может быть обратным в присутствии ЭДТА.

Необходимость Са2+ для работы нейраминидазы, вне ее связи с фактором термостабильности, была предметом дискуссии в течение нескольких лет. Хотя повышение активности было налицо, трудно 'было показать абсолютную необходимость для работы фермента присутствия именно Са2+. Wilson и Rafelson (1967), удаляя ионы кальция с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом или с помощью добавления ЭДТА для полного связывания их следов, показали снижение на 20% активности нейраминидазы N2; максимальную активность можно получить, добавив 0,1 мМ Са2+. Почти абсолютная необходимость присутствия ионов кальция была показана Dimmock (1971) для нейраминидазы WSN(Nl). В отсутствие Са2+ ак~чвность нейраминидазы составляла около 1 % исходной активности, для получения максимальной активности требовалось 3 мМ Са2+. Нейраминидаза типа N2 (Япония) требовала для своей максимальной активности 0,3 мМ 2+Са. Та'ким образом, имеется десятикратное различие

в потребности в ионах 'кальция для нейраминидазы типа N1 и нейраминидазы типа N2. Особые трудности возникают при изучении действия малых (концентраций ионов кальция (особенно в случае нейраминидазы N2) в связи с тем, что 'большинство субстратов содержат двухвалентные ионы в количествах, достаточных для обеспечения потребности вирусной нейраминидазы (N2) в ионах кальция (Wilson, Rafelson, 1967).

В нескольких работах по изучению термостабильности было показано, что NA типа N1 относительно термолабильна, a NA типа N2 термостабильна. Rafelson и соавт. (1963а) показали, что нейраминидаза PR8(N1) полностью инактивиру-ется при нагревании до 55 °С в течение 30 мин, в то время как нейраминидаза азиатского штамма (N2) сохраняет 67% своей активности при аналогичной обработке. Paniker (1968) обнаружил, что термостабильность нейраминидазы вируса гриппа меняется в широких пределах. Штаммы A2(N2) обладают наиболее термостабильным ферментом, на активность которого не влияет нагревание в течение 1 ч при 45°С, а нейраминидаза штаммов NWS и WSE(Nl) наиболее термолабильна.

V. СОДЕРЖАНИЕ НЕЙРАМИНИДАЗЫ В ОБОЛОЧКЕ ВИРУСА

Как было определено, для таких штаммов вируса гриппа, как А0/Ве1/42, который содержит нейраминидазу типа N1 (Skehel, Schild, 1971), как рекомбинант Х7, в состав которого входит нейраминидаза типа N2 (Laver, Kilbourne, 1966) и вируса гриппа В, штамм B/Lee (Laver, 1963), содержание нейраминидазы составляет около 7% от суммарного содержания белков в вирионе. Несмотря на совпадение величин, полученных в этих работах, было обнаружено, что количество нейраминидазы, включающейся в вирусную частицу, может быть недостаточным и зависит от типа клеток, на которых выращивают вирус, и от штамма вируса. Laver (1963) обнаружил, что количество NA* зависит от типа клеток-хозяев и составляет 6% от общего вирусного белка при выращивании вируса in ovo и 14%, если вирус выращивается на клетках почки теленка. Laver и Kilbourne (1966) обнаружили, что в рекомбннантном штамме X7(F1) (H0N2) содержится в 2 раза больше «ейраминидазы, чем в штамме X7(H0N2) при выращивании вирусов in ovo. Palese и Schulman (1974) обнаружили десятикратное различие в содержании нейраминидазы в двух антигенно идентичных лабораторных рекомби-нантах вируса гриппа (H0N2), выращенных in ovo. Mow-showitz и Kilbourne (1975) наблюдали подобные различия в нейраминидазной активности изолированных вирусов двух

штаммов Aichi (H3N2) дикого типа. Используя метод подсчета частиц, Seto (1964) обнаружил, что неполный вирус штаммов PR8 (H0N1) и Япония/305 (H2N2) обладает нейр-аминидазной активностью, в 2—4 раза меньшей, чем стандартный вирус.

Если считать, что содержание NA* составляет 7% суммарного (белка вириона (а белок составляет 70% массы всей вирусной частицы) (Frommhagen et al., 1959), и принять за массу одной вирусной частицы величины W = 4-10~16 (Reimer et al., 1966), то число молекул NA* на один вирион можно определить из следующего уравнения (Skehel, Schild, 1971). Предполагается, что NA* представляет собой тетрамер с относительной молекулярной массой 24 000 (Wrigley et al., 1973), а N — число Авогадро:

^%NA = 49 молекул NA па вирион

Kendal и соавт. (1968) определили абсолютное содержание белка на один вирион, равное 4-Ю-16 г, и, основываясь на содержании NA* в 10% от суммарного белка вириона и на ее молекулярной массе в 220 000, рассчитали, что в вирионе гриппа штамма А/Сингапур/1/57 (H2N2) содержится 100 молекул NA* на одну вирусную частицу. Поскольку, согласно расчетам Tiffany и Blough (1970), на поверхности вирусной частицы содержится 550—600 «шипов», можно считать, что 50—100 из них представляют собой NA*, а остальные 500—'НА*.

А. СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ НЕЙРАМИНИДАЗЫ

Для изучения свойств NA* (как ферментативных, так и антигенных) удобно иметь 'фермент, отделенный от других компонентов вирусной оболочки. Поскольку NA* локализована в вирусной оболочке, именно это предопределяет способы ее солюбилизации и отделение от вириона и других вирусных компонентов. Методы солюбилизации NA* можно разделить на две группы: а) солюбилизация с помощью протеолитиче-еких ферментов и б) солюбилизация с помощью поверхностно-активных веществ. Особенности выделения NA* с помощью обоих методов приведены в табл. 13.

Солюбилизация .NA*, по-видимому, не меняет ее ферментативных свойств. Активная в биологическом и антигенном отношении NA* была выделена протеолизом или с помощью поверхностно-активных веществ ионной и неионной природы (Drzeniek et al., 1966). После выделения NA* имела ту же, что и до выделения, величину Км, оптимум рН и Са2+-зави-симость (Drzeniek et al,, 1966). Выделенную из вириона после обработки детергентами или протеолитическими ферментами iNA* нейтрализовали антисывороткой в той же степени, что и NA* интактного вириона (Ea'sterday et al., 1969). Одна-

ко Webster и Laver (1967) обнаружили, что выделенная с помощью детергента -NA* типа N2 обладает «дефицитом» анти-генности по сравнению с антигенностью NA* того же типа in situ.

Было показано, что iNA* вируса гриппа штамма B/Lee является наиболее стабильной и может -быть выделена практически с 100% выходом после обработки вирионов SDS или трипсином (Laver, 1963). NA* вируса B/Lee, кроме того, нечувствительна к дезоксихолату натрия (Laver, 1963). Что .касается вируса гриппа типа А, то наиболее просто с помощью обработки SDS или протеолитическими ферментами выделяется -NA* из штаммов А2 (N2). Эта NA*, кроме того, относительно температурно-етабильна. Использование нейтральных детергентов позволило выделить NA* типа N2 (Webster, Darlington, 1969), а также iNA* типа N1, выделение которой в чистом виде особенно трудно (Gregoriades, 1972). Hoyle и Almeyda (1971) показали, что NA*, выделенная из штаммов вируса гриппа типа А2 (N2) и B/Lee, почти полностью устойчива к действию проназы и трипсина; NA*, выделенная из штаммов PR8 (N1) и свиного (N1), лишь отчасти устойчива, a NA* вируса гриппа типа А1 (N1) и штамма A/DSP (

Для солюбилизации NA* такие методы, как разрушение ультразвуком, эфиром или денатурирующими агентами (мочевина или гуанидингидрохлорид), применимы в малой степени, вероятно, в связи ,с высокими агрегационными свойствами этого фермента. Разрушение вирионов с помощью эфира, по-видимому, высвобождает НА* и NA* в виде сополимер-ного агрегата (Hoyle, 1952; Davenport et al., 1960; Schafer). Этот вид разрушения вирусных частиц в основном использовали до того, как Laver изолировал NA* (Hoyle, 1952; Lief, Henle, 1956; Paucker et al., 1959; Hoyle et al., 1961).

Предпочтительным является такой ,вид изоляции NA*, который не требует разрушения ковалентных связей. Использование детергентов для солюбилизации iNA* позволяет выделить и другие вирусные белки, которые в химическом отношении не отличаются от соответствующих вирусных компонентов, хотя и могут терять свою биологическую активность (Bucher, 1975). По-видимому, при протеолитической солюбилизации NA* теряет некоторую часть своей молекулы, необходимую для удержания фермента на вирусной оболочке и не участвующую в ферментативном акте. Lazdins и соавт. (1972) показали, что в отличие от изоляции NA* с помощью детергента (SDS) или лротеолитичеоком (трипсин) выделении из штамма B/Lee каждая субъединица фермента теряет

отрезок -молекулы в 7000; по данным Wrigley и соавт. (1973), при тех же условиях каждая субъединица NA* B/Lee теряет участок в 12 000.

Основное различие, наблюдаемое при лротеолитическом и детергентном выделении NA*, состоит в том, что при солюби-лизации с помощью протеолитичеоких ферментов она теряет способность к агрегации. При (протеолитичеоком выделении имеет место «действительная» солюбилизация, в то время как iNA*, полученная с помощью детергентов, агрегирует при удалении солюбилизирующего агента (Lazdins et al., 1972). Каждый этап очистки NA* после ее солюбилизацин с помощью детергента должен выполняться в его присутствии для того, чтобы, во-первых, иметь дело с ферментом в диссоциированном состоянии, а Ео-вторых, для предотвращения потери его активности. Laver и Valentine (1969), а также Rott и соавт. (1970) показали наличие агрегатов в препаратах iNA* типа N2 при удалении детергента. По данным Grego-riades (1972), при удалении детергента NA* штамма WSiN (N1) агрегирует и теряет свою активность. Webster (1970b) обнаружил высокую агрегационную способность для NA*, выделенной из вирионов с помощью детергента, даже в присутствии 6 М гуанидингидрохлорида в условиях восстановления.

1. Использование протеолитических ферментов

Протеолитические ферменты различной специфичности или смесь протеолитических ферментов (таких, как пролаза) могут использоваться для солюбилизации NA* в активной форме. Это свидетельствует, во-первых, что активный центр NA* в высокой степени устойчив к протеолизу и, во-вторых, что отрыв гидрофобного «хвоста» может быть осуществлен практически любым протеолитвческим ферментом. Для отщепления необходимо наличие нескольких ключевых аминокислот; произойдет ли гидролиз в том или другом месте — не имеет большого значения. Протеолитические ферменты обычно попользуются в высоких концентрациях (1—2 мг/мл и выше), которые сравнимы с .концентрацией вирусных (белков при малом времени инкубации. Поскольку NA* вируса находится в «нативном» состоянии, она, по-видимому, более устойчива к протеолизу, чем после денатурации фермента. Углеводные остатки NA* могут играть роль «защитников» фермента от атаки протеолитичеокими ферментами, а также «направлять» протеолитические ферменты к специфическим областям, в которых должен произойти разрыв цепи. Что касается ферментов, используемых для солюбилпзации NA*, то следует отметить, что трипсин, обладая  наивысшей  из  всех

известных эндопептидаз степенью специфичности места разрыва, расщепляет |бело,к в области карбоксильного конца остатков лизина и аргинина (Walsh, 1970). Химотрипсин расщепляет белок преимущественно по ароматическим аминокислотам полипептидной цепи (Wilcox, 1970). Пептидаза На-гарсе (или субтилизин BPN') является сериновой протеазой, расщепляющей большое число пептидных и эфирных связей (Ottesen, Svendsen, 1970). Проназа представляет собой смесь нескольких протеолитических ферментов, включая эндопеп-тидазу и экзопептидазу, .продуцируемые штаммом Streptomy-ces griseus K-l (Narahachi, 1970).

2. Использование детергентов

Детергенты, используемые для изоляции вирусных

УспешноевыделениевактивномсостоянииспомощьюэлектрофорезавцеллюлозоацетатныхпластинахвприсутствиизависитоттогоимеемлимыделосчувствительнымНАинечувствительнойПослеразрушениявирусныхчастицспомощьюмигрирующаяподдействиемэндооомотическогопотокадвижетсяккатодуиотделяетсяотНАДляштаммовтипаАНАимигрируютсовместноккатодуидлявыделениятребуетсяпровестигенетическуюрекомбинациюсболеераннимивариантами вируса гриппа для того чтобы получитьНАинактивируемыйвприсутствиимигрирующийканодуштаммаденатурируетвприсутствии

БОЧИСТКАНЕЙРЛМИНИДАЗЫ

ВследзасолюбилизациейизпрепаратовочищенноговирусаееможновыделитьсиспользованиемкомбинацииседиментационныххроматографическихиилиэлектрофоретическихметодовПосколькуактивныйферментимеетконстантуседиментации—адругиевирусныекомпонентымогутиметьболеенизкиеилиболеевысокиескоростиседиментацииобычнопервымэтапомочисткиявляетсяультрацентрифугированиевыполняемоечащесиспользованиемградиенталибосахарозылибоглютаматанатрияПоследнийметодудобентемчтоприегоиспользованииможнопрямоизмеритьактивностьспомощьютиобарбитуровойкислотыбезнежелательноговлияниясахарозыСпомощьюотносительнонизкоскоростногоцентрифугированияобычноотделяютотвирусныхчастицапривторомцентрифугированиисболеевысокойскоростьюилисболеекрутымсахарознымградиентомотделяютмедленноседиментирующиевирусныебелкиоткотораяседиментируетсбольшейскоростью

ПоследующиеэтапыочисткиобычновключаютхроматографическиеметодыразделениямакромолекуллибопоразмерамкаквслучаегельфильтрациисиспользованиемсефадексаилибиогелялибометодыразделениясиспользованиемионообменныхсмолтакихкакцеллюлозанакоторойтипадовольноэффективноадсорбируетсяпринейтральныхзначенияхрНиспользовалметодэлектрофорезанацеллюлозоацетатныхпластинахвприсутствииВсвязистемчтометодэлектрофорезавполиакриламидномгелевприсутствиипозволяетпроводитьразделениемакромолекулпоразмерамэтотвидэлектрофорезабылиспользовандлявыделениявирусагриппаДляизоляцииизсмесибелковсолюбилизированнойспомощьюдетергентовиспользовалииметодэлектрофокусировкиОчиститьблагодаряееферментативнойактивностиможнометодомафиннойхроматографииприиспользованииколонкиснизкомолекулярнымингибиторомнейраминидазнойактивности—аминофенилоксамовойкислотойЕслиучестьчтовирусагриппапредставляетсобойгликопротеидееможновыделитьиспользуяафиннуюхроматографиюсиспользованиемлектинов

ВОПРЕДЕЛЕНИЕСТЕПЕНИОЧИСТКИ

ПослеизоляцииизвирионовможноиспользоватьнесколькокритериевеечистотыОдинизних—увеличениеудельнойактивностивстандартныхусловияхЕслипринятьчтосоставляетвсехбелковвирионатомаксимальноеувеличениеудельнойактивностипрепаратаможетсоставлять—разОднакоэтоткритерийоченьтрудноиспользоватьнапрактикепосколькусоднойстороныимеетместоувеличениеактивностипривыходеееизвирионаасдругой—наееактивностьодновременновлияетбольшоечислоденатурирующихфактороввзависимостиотусловийсолюбилизацииитипаиспользуемогоштаммавирусаВсвязисэтимоченьтрудносудитьостепениочисткиосновываясьнаееудельнойактивности

ВкачествекритериячистотыпрепаратаиспользовалиотсутствиеадсорбцииегонаэритроцитаходнаконесмотрянаналичиеэтогосвойствапрепаратвсежеможетсохранятьспособностькиндукцииантителкНАТакимобразамдополнительнымкритериемстепеничистотывыделеннойможетбытьточтоприееиспользованиивкачествеиммуногенанепродуцируютсяантителакдругимкомпонентамвириона

ПосколькувнастоящеевремяхорошоизвестноположениеполосыприэлектрофорезевполиакриламидномгелеоднимизкритериевеечистотыможетбытьприсутствиеоднойполосывысойомолекулярногбгликопротеидаприпроведенииэлектрофорезавневосстанавливающихусловияхПослевосстановленийэтаполосадолжнапревратитьсяводнуилидвеполосыположениекоторыхсоответствуетотносительноймолекулярноймассеприблизительноприполномотсутствиидругихполосВэтомслучаенаполиакриламидный гельследует нанести —мкгбелка     

СВОЙСТВАИЗОЛИРОВАННОЙНЕЙРАМИНИДАЗЫАСОСТАВАМИНОКИСЛОТ

Всвязистемчтополученнаяпридействиинавирноныпослеудалениядетергентаагрегирует«хвостами»вероятнозасчетихгидрофобныхсвойствсмипосколькуизвестночтоэтичастимолекулыотщепляютсяприлротеолизеинтересносравнитьобщеечислополярныхинеполярныхостатковдлятипаполученнойспомощьюдетергентногоилротеолитическогометодовЕстественночтоболеенадежнобылобыпровеститакоесравнениеиспользуяданныеполученныеоднойгруппойисследователейоднакоксожалениютакихрезультатоввнастоящеевремяещенетЕслисчитатьчтополярнымиаминокислотнымиостаткамиявляютсялизингистидинаргининасларагиноваякислотатреонинсериииглутаминоваякислотатосредиаминокислотныхостатковсмранееимеетсяполярныхдлявыделеннойспомощьюдетергентногометодаиполярныхостаткадляферментаизолированногоспомощьюпротеолизатевпоследнемслучаенаблюдаетсядефицитполярныхостатковЕсливкачественеполярныхостатковрассматриватьпролинвалинметионинизолейцинлейцинтирозинфенилаланинисуммарныйцистеинможновидетьчтовизолированнойспомощьюдетергентасодержитсянеполярныхостатковполученнаяпридействиипротеолитическогоферментавключаетнеполярныйостатоктевпроцессеобработкиферментомтеряетсянеполярныхаминокислотныхостатковТакимобразомаминокислотывобластикотораятеряетсяприлротеолиземолекулынеявляютсявзначительнойстепениболеегидрофобнымичемаминокислотывходящиевсоставактивнойчастимолекулыВероятноконформацияшолипептиднойцепигораздоболееважнадлясозданиягидрофобногохарактераэтойобластичемтипаминокислотвходящихвеесостав

ЧислоостатковлизинаиаргининапредставляетинтересвсвязисизучениемпептидныхкартгидролизатовнейраминидазыполученныхспомощьютрипсинаиопределиличтовкаждойсубъединицесодержитсяостаткализинаиаргининаидаютвеличинуостатковДанныепообщемучислуцистеиновыхостатковэтихавторовтакжесущественноотличаютсяиопределилиостатокцистеинаи—Этиисследователинашлитакжеразличноечислометиониновыхостатковдляодногоитогожетипанейраминидазыиприводятвеличинуи—Содержаниеостатковметионинавнейраминидазеважнодляисследованияструктурыэтогоферментаспомощьюегорасщепленияцианидомброма

котороепроисходитпоостаткамметионинаОсновываясьнаработеиможнопредположитьчтоврезультатетакогорасщепленияобразуется—фрагментованаоснованииработыитакихфрагментовдолжнонаблюдатьсяилиДляразрешенияэтогопротиворечиятребуютсядополнительныеисследованияпоопределениюсоставааминокислот

Оченьмалоизвестнообуглеводнойчастинейраминидаз■ногогликопротеидаПоивмолекулеферментасодержитсяостаткаглюкозаминаисоавтсообщилиопотерепривыделениинейраминидазыспомощьюпротеолитическихферментоввобластимакромолекулысвысокимсодержаниемглюкозамина

БАМИНОКИСЛОТЫАКТИВНОГОЦЕНТРА

НекоторыеисследователипыталисьопределитьприродуаминокислотныхостатковвходящихвактивныйцентроднакополученныерезультатыбылинеоднозначныпривелдоказательстваприсутствияостатковтирозинаигиетидинавактивномцентреинесделалкакихлибоопределенныхзаключенийобостаткахцистеинаметионинатриптофанааргининаилизинаСдругойстороныпроведяисследованиесбромсукцинимидноймодификациейсбольшойуверенностьюуказываетнаналичиевактивномцентретриптофанаИзолированнаяспомощьюпроназывирусагриппатипаАполностьютеряласвоюактивностьпослеобработкибромсукцинимидомСубстратытакиекаксиалиллактозаилифетуинпредохраняютферментотподобногородаинактивации

ВИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКАЯТОЧКА

Изоалектрическаяточкабылаопределенадляполученнойкакпротеолитическимтакидетергентнымметодамиисоавтисоавтобнаружилибольшиеразличиявизоэлектрическихточкахтипавзависимостиоттогопротеолитическимилидетергентнымметодомбылполученферменточищалатипаспомощьюнеионныхдетергентовиполучилагомогенныйпрепаратсизоэлектричеокойточкойясоавтобнаружилиприизоэлектрическомфокусированиитипапокрайнеймерепиковвпределахотдососновнымипикамивобласти—ВобоихслучаяхизоэлектрическаяточкабыласлегкасдвинутавкислуюобластьДенатурированнаяимелаизоэлектриче

скуюточкуна—единицрНнижечемнативныйферментчтоуказываетнавозможноеконформационноемаскированиевнативноймолекулебольшогоколичествабоковыхкарбоксильныхгруппДлявыделенныхизштаммовиисоавтобнаружилипикивпределахрНотдоЭтоуказываетнаточтоизоэлектрическаяточкаувируснойближекнейтральнымзначениямрНчемуиликоторыеимеютфиксированныезначенияизоэлектрическихточекисоавтнеиспользовалидетергентвопытахпоэлектрофокусированиюхотясамабылаполученаизвирионовспомощьюдетергентаивсвязисэтимвозможнымобъяснениемгетерогенностиизоэлектрическойточкиможетбытьэффектагрегацииполучилафиксированнуюизоэлектрическуюточкуприрНдляизолированнойспомощьюдетергентавприсутствиивсреденеионныхдетергентовМожноожидатьчтопрепаратвыделенныйспомощьюобработкипротеолитическимиферментамигетерогенензасчетвозможноймножественностиместразрывовполипептиднойцепиОднакоисоавтобнаружилигетерогенностьдажепослетогокакотделилииндивидуальныйпикпослеизоэлвктрофокуоировкиисновананеслиегонафокусирующуюколонку

СТРУКТУРАНЕЙРАМИНИДАЗЫ

СовершенноточноустановленочтосуществуетнаповерхностивирионавирусагриппаввидепалочкообразныхвыступовВнастоящеевремяоднакоещениктонедостигтакогоразрешенияэлектронногомикросколакотороепозволилобыобнаружитьразличиемежду«шипами»навируснойповерхностииоднозначноидентифицироватькакиеиз«шипов»являютсяакакиеНАинесмоглиидентифицировать«шипы»всвязисбольшойблизостьюэтихповерхностныхструктурдругкдругуКакитакиисоавтуказываютнавыявлениенаповерхностивирионовпослеихинкубациисовместносантисывороткойкобластейгдеконцентрируютсяантителаСледовательноможетбытьсосредоточенавлокальныхучасткахповерхностивирионаЭтинаблюдениякрометогоподтвердилитотфактчтонелокализованатолькоуоснованияшиповпосколькуантителаприкреплялиськихвнешнимконцам

Внезависимостиоттогопротеолитичеакимилидетергентнымметодомизолируетсяизвирионоввирусагриппаонаседиментируетвобласти—иимеетотносительнуюмолекулярнуюмассу—Крометогоизолированнаяспомощью протеолитическихферментов имеетнемногоболеенизкую   скорость   седиментацииименьшуюмолекулярнуюмассучемполученнаяизвирионовспомощьюдетергентовисоавтрассчиталичтотипа полученнаяспомощьюсояюбилизациитрипсиномимеетотносительнуюмолекулярнуюмассуЭтирасчетыосновывалисьнаконстантеседиментациивипарциальномудельномобъеме  равномомгисоавтпровелианалогичныерасчетыдлятипаизолированной с помощью  протеазы  Нагарсе  и  получилимолекулярнуюмассу  принимая константу седиментацииравнойсмгПоданнымисоавт  которые использовали величины смгимолекулярнаямассавыделеннойизштаммас помощьюобработки вирионов   трипсином   была   равнаБолеевысокиеконстантыседиментациибылиполученыдлявыделеннойспомощьюобработкидетергентом и     нашли этуконстанту равнойдлятипаХ  обработкатвиноми     определили величину константы в  длятипа ХприеевыделенииспомощьюПривыделенииспомощьювирусагриппатипаАимеетконстантуседиментацииравную иобработкаеепроназойснижаетэтуконстантудо       НаоснованииопытовпроведенныхвусловияхвосстановленияпредполагалосьчтоактивнойформойявляетсятетрамерНесколькогрупписследователейпоказаличтоактивныечастицысконстантойседиментациимогутдиссоциироватьнамономерыотносительноймолекулярноймассой—   после   обработки   восстанавливающимиагентамитакимижакмеркаптоэтанолидатиотриэтол а   ТвердаяуверенностьвсуществованиитетрамернойструктурывозниклапослепубликацииисоавтихэлектронномикроскопическихснимковНанихвыделеннаяспомощьюпротеолитическихферментоввыглядиткакпланарнаятетрамернаячастицамономеркоторойпредставляетсобойскорееобразованиежубическойчемсферическойформысдлинойребраоколонм смЕслитетрамерывыделяютсяспомощьютоонисохраняютнитевидныеобразованияили«хвосты»длинойоколонмсутолщениемнаконцедиаметром околонм   

ТетрамернаяструктураявляетсянеобходимымусловиемналичияактивностипроводяопытыпогельфильтрациивградиентеобнаружилаферментативнуюактивностьменьшихчемтетрамерыобразованийОднакокакясноизнаблюденийивопытахмоглареасооциироватьеобразованиемтетрамеровужепослеэлюциипригельфильтрацииХотяпослехроматографиинаколонкесбиогелемАфирма«»СШАиэлюируетсяввидечастицсотносительноймолекулярноймассойферментспособенкспонтаннойреассоциациивактивныететрамерныеоубъединицычтобылопоказаноцентрифугированиемвградиентеплотностисахарозыРазличныеуровниассоциациимономеровсуказаниемихферментативнойактивностиприведенына

Хотядисульфидныесвязиииграютбольшуюрольвподдержаниитетрамернойструктурывидимомуониважнывовнутримолекулярныхииливмеждимерныхвзаимодействияханевовзаимодействияхмеждувсемичетырьмясубъединицамисмипоказаличтодиффузияприэлектрофорезевполиакриламндномгелебез добавления восстанавливающих агентовпроисходитпо

законамсправедливымдлямолекулсотносительноймолекулярноймассойвышетаковойтетрамеров—исоавтпроводяэкспериментвневосстанавлювающихусловияхнашлидляштаммаполосусоответствующуюмолекулярноймассевДляполучениямономерныхсубъединицъэтихопытахбылонеобходимовосстановитьдисульфидныесвязиАвторыэтихработпредположиличтомономерысоединеныдругсдругомвдимерныхобразованияхдисульфиднымисвязямиасвязидимеровприформированиитетрамерныхструктурносятнековалентныйхарактер

Хотятетрамернаяструктуравнастоящеевремятвердоустановленанеясноформируетсялионачетырьмяэквивалентнымимономерами  или двумя типами неэквивалентныхмономеров  Предполагаютчтоналичиевмолекулеодногоилидвухтиповсубъединицзависитотштаммавируса То что   имеет булавообразную форму можетозначатьналичиевеесоставеболееодноготипамакромолекулИсследователиизучавшиетипаизолированнуюизрекомбинантныхштаммовХиХ     спомощьюдетергентногометодаобнаружилидвакомпонентахотяразныеавторыдаютразличныесоотношениямеждуколичествоммономерныхединицдвухтипов       исчитаютчтомономерысуществуютввэквимолярныхколичествахдругиеавторыпоказалиболеенизкуюконцентрациюдлякомпонентасбольшейэлектрофоретическойподвижностью       Поданными всоставрекомбинантаХ входиттолькоодинтипполипептидаСледуетоднакоотметитьчтоавторыизолировалиферментс  помощью  протеолитического  метода    •обнаружилалишьодинвидсубъединицдля выделенныйизвирионовгриппаштаммаПриисследовании выделенной из штамма  был также обнаружентолькоодинкомпонент       

инаблюдалитолькооднуполосулолипептидаприэлектрофорезепослевосстановленияХвыделеннойизвирионовгриппапротеолитическимметодомПептидныекартытрипсиновыхгидролизатоввыделеннойиротеолитическимметодомпоказалиналичиетолькоодноготипасубъединицТакойвыводбылсделаннаосновеподсчетачисларадиоактивныхсульфгидрильныхгруппПослерасщеплениятрипсином■субъединицмеченнойСспомощьюкарбоксиамидометилированияи наблюдалиоколопя

тенприауторадиографиипептидныхкартчтосбольшойстепеньювероятностиуказываетнаприсутствиевтолькоодноготипасубъединицпосколькувнихбылнайденостатоксуммарногоцистеинаЕслибывсуществовалодватипасубъедиництодолжнобылобынаблюдатьсядвойноеколичествопятенОднакоиобнаружилитолькоцистеиновыхостатковПоэтомудвойноеихколичестводолжнобытьравночтовпределахэкспериментальнойошибкисовпадаетспептидамиобнаруженнымиинапептидныхжартахМожнотакжепредположитьчточисловидовпептидоввможетзависетьотметодавыделенияферментаОднакопептидныекартыполученныеспомощьюобоихметодовнепоказалисущественныхразличийнеопубликованныеданные

исоавтпредположиличтовслучаяхкогданаблюдалосьдватипаполипептидовкомпонентасболеевысокойэлектрофорезяойподвижностьюподвергаласьпротеолизуипридерживаютсятакойжеточкизренияДругоевозможноеобъяснениеможетзаключатьсявразличииуглеводнойчастимономеровВыяснениевопросаоразличиидвухтиповмономеровдействительныхилиартефактныхсвязаносразделениемиизоляциейэтихмономеровНаличиедвухтиповсубъединицвувеличилобытрудностиприеегенетическомизученииивместестемвозможныйпотенциалеегенетическойизменчивости

АНТИГЕННЫЕСВОЙСТВАНЕЙРАМИНИДАЗЫ

НейраминидазасчитаетсяважнымвантигенномотношениикомпонентомвирионаУникальностьвирусагриппазаключаетсявтомчтоонабудучиферментомиграеткрометогорольантигенапризаболеваниигриппомАнтителакмогутсоздаватьзащитупротивгриппаиизменятьтечениеболезнисмглИспользуярекомбинантныештаммысодержащиераспространеннуювнастоящеевремяисерологическиизмененныегемагглютининыисоавтпоказаличтоантителакингибируютвируснуюрепликациювклеткахлегкогомышиуменьшаюттитрвирусаистепеньпоражениялегких

КакиНАподверженаантигеннымсдвигамидрейфуНейраминидазнаякомпонентавирионаменяетсявпроцессеантигеннойизменчивостиХотяновыйтипвирусагриппа—типА—возниквгиприэтомнаблюдалисьоченьсущественныеизмененияНАнейраминидазнаякомпонентановоготипадавалаположительныйответв«россреакцияхсвирусагриппа

АОипоэтомуАизобоихтиповвирусабылиобозначеныоднимсимволом—В—ггвозникновыйтипвирусаАПриэтомобразовалсякакновыйНАтакиноваяКакпоказалисоавтаЬвэтомслучаекроссреакциимеждуантисывороткамиказиатскимштаммамиантисывороткамикиликвирусугриппаВотсутствовалиШтаммвозникшийвгобладалновымтипомНАНЗаего—высокийкроссреактивностьюсоштаммамивирусатриппаАивсвязисэтимдляееобозначениябылвновьиспользовансимволОднаконебольшоеизменениетакназываемыйантигенныйдрейфвсеженаблюдалосьвлетниепериодыотделяющиекардинальныеантигенныесдвиги

Взаимодействие«ейраминидазысантителамиможетбытьизученоспомощьюнесколькихметодовКнимотносятсятакиеметодикикакингибированиеферментативнойактивностииммунопреципитацияопределениеуменьшенияразмерабляшекитестытитрованиянамышахПолосуиммунопреципитацииможнонаблюдатьпослепроведенияиммунодиффузииприиспользованиинизкомолекулярногохромофорногосубстратаМФН

Наиболееширокораспространеннойметодикойопределенияналичияантинейраминидазныхантителявляетсяреакцияторможениянейраминидазнойактивностисиспользованиемвысокомолекулярныхсубстратов—гликопротеидовсодержащихнейраминовуюкислотуУровеньингибированияантителомнезависитотконцентрациисубстратаРеакцияподавлениянейраминидазнойактивностибыластандартизованапричемвэтомслучаевкачествесубстратаиспользовалифетуиназастепеньподавленияактивностипринималивеличинуразведенияисходногораствораантителприкоторомнаблюдаетсяподавлениенейраминидазнойактивноституЕслиоткладыватьнаграфикепроцентингибированиявзависимостиотлогарифмаразведенияантисывороткидолжнаполучитьсяпрямаялинияОбычныеусловияпроведенияэтоготестаконцентрацияфетуинавМфосфатномбуферерНтзприсутствиимМСаСЬвобъемемлЧувствительностьреакциивозрослазасчетувеличениявремениинкубациинейраминидазысантисывороткойисубстратомчпри°С

Былообнаруженочтостепеньингибированиянейраминидазнойактивностизасчетвзаимодействиясантителамиза

виситотразмеровмолекулысубстратаТакаяжезависимостьнаблюдаласьидлянейраминидазыБылопоказаночтонейраминидазнаяактивностьвирусагриппаингибируетсяспецифическимиантителамиесливкачествесубстратаиспользоватьвысокомолекулярныйсубстраторозомукоидфетуинилилликопротеидвыделенныйизмочииингибируетсяслабоиливообщенеингибируетсяприиспользованиинизкомолекулярныхсубстратовтакихкаксиалиллактозаЭтоуказывает«аточтоингибированиеактивностинейраминидазы—стерическийпроцесстеантителовзаимодействуетнесактивнымцентромферментаассоседнимучасткомилиучасткамиистепеньингибированиявозрастаетсростамотносительноймолекулярноймассыиспользуемоговреакциисубстрата

СравниваяштаммывирусагриппаАиВобнаружилчтоввирионахштаммаАОнейраминидазарасположенатакимобразомчтолегкодоступнадлянейтрализацииантителамиимаксимальнаястепеньингибированияприиспользованииодногоитогожесубстратавышедляштаммаАМечемдляштаммаДляштаммавирусагриппаАнаблюдалосьстерическоеингибированиеантителамиприиспользованиивысокомолекулярныхсубстратовислабое—прииспользованиивкачествесубстратасиалиллактозыВотличиеотэтогодляштаммавирусагриппаВингибированиеотсутствовалоприиспользованиисиалиллактозыингибировалисьприиспользованиивысокомолекулярныхсубстратовтакихкакфетуинорозомукоидимукоидмочиобработанныйтрипсиномиприиспользованииоченьбольшихсубстратовэритроцитымукоидмочииовомуцинЭтоможетсвидетельствоватьотомчтовштаммахвирусагриппаВрасстояниемеждуантигеннымиактивнымцентромбольшечемвштаммахгриппаА

ПрирасщепленииантителспомощьюпапаинастерическоеингибированиерезкоуменьшаетсяхотяконстантасвязыванияантителвобоихслучаяходинаковаКрометогоингибированиенейраминидазнойактивностиноситнеконкурентныйхарактеризависитотрасстояниямеждуантигеннойдетерминантойиактивнымцентромферментаразмераиформымолекулысубстратаразмерамолекулыантителаОценкавеличинырасстояниямеждуантигеннымиактивнымучасткаминейрамияидазыдалавеличинуимЭтиэкспериментыбылипроведенысантисывороткойкцельнойвируснойчастицесодержащейантителакаккгемагглютининутакикнейраминидазеДляподтвержденияприведенныхвышевыводовнеобходимопровести

аналогичныеэкспериментысиспользованиеммоноспецифическойсывороткикнейраминидазе

ТочтоактивныйцентрферментанепринимаетучастияввыработкеантителхарактернонетолькодлянейраминидазыПовидимомуэтосвойствоприсущенекоторымдругимферментамиявляетсяпоказателемотсутствиямутабельностиактивногоцентраубиологическихвидовОднимизобъясненийэтогофеноменаможетбытьточтоеслибыорганизмраспознавалактивныйцентрвируснойтакжекакактивныйцентрсвоейсобственнойоннесмогбывыработатьантителаквирусномуферменту

АнтителакНАвразличнойстепениингибируютактивностьнекоторыхштаммоввирусагриппаИнгибированиеактивностивызванноеантителамикНАнесмеломестаеслиХизолировалиизвирионаспомощьютвинаилилроназыИнаоборотантителакмогутподавлятьгематтлютинациюнекоторыхштаммоввирусагриппаОднаковбольшинствеслучаевантителакнеингибируютреакциюгемагглютинацииноэффективноподавляютэлюциювирусаРеакцияингибироваяиягемагплютинациибылаиспользованадлявыявленияантителкрекомбинантовХ«ХНКЧувствительностьэтоготестабылаповышенаприиспользованииантителчеловекасмтакжегл

ЛЕКТИНЫИНЕЙРАМИНИДАЗЫ

КонканавалинАявляясьлектиномифитогемагллютининомингибируетподобноспецифическим антителам активностьвирусагриппавслучаекогдавкачествесубстрата используютвысокомолекулярныесоединениятакиекакфегуинКонканавалинАагглютинируетвеществаимеющиевсвоемсоставеплюкопиранозидные маннопиранозидные ифруктофуранозидные   ядра            Какиуантителлинияпреципитацииможетбытьобна  руженаприиммунодиффузиисиспользованиемнизжомолекулярногохромофорногосубстратаМФНесливместоантисывороткивзятьрастворконканавалинаАадиффузиюпроводитьпротивразрушенноговирусаЭтоявлениеимеетместодаженесмотрянаточтоконканавалинАподавляетактивностьприиспользованиивысокомолекулярногосубстрата ТакимобразомконканавалинАведетсебяподобноантинейраминидазньщантителамтеблокируетактивныйцентр ферментаненепосредственноа засчетстерИческогоэффекта

исоавтпродемонстрировалипреципитациюспомощьюконканавалинаАполагаячтоэтотэффектсвязансвзаимодействиемконканавалинасоднимизповерхностныхкомпонентовЭтиавторыкрометогопоказаличтодобавлениеконканавалинаАкфибробластамкуриногоэмбрионаинфицированнымвирусомпредотвращаетоборкуилиотделениевирусаотклеткиЕсливирусразрушалсяспомощьютритонаХтогемагглютинирующаяактивностьобнаруживаласьвсупернатантевыпадалавосадкахвместесконканавалиномАОднакоеслиизолировалиспомощьюпротеолитическогоферментатолькозееосаждалась«онканавалиномАазоставалисьвраствореСледовательноприлротеолитическомвыделенииотнееотщепляетсяфрагментсвысокимсодержаниемуглеводовкакэтоужебылопоказаноисоавткоторыеиспользоваливсвоейработедругиеметоды

РанееисоавтвысказалипредположениечтоактивностьблокируетсяконканавалиномАчерезвзаимодействиесгемагглютининомОднакоизолированнаяблокироваласьвтойжестепениитемжеобразомчтои

БылаобнаруженаштаммоваязависимостьингибированияспомощьюконканавалинаАВероятноуглеводныеостаткинаповерхностивирионалегкодоступныивысвобождениеферментанеобнажаеткакиелибоскрытыеранееобластиКрометогоизолированнаяможетадсорбироватьсянасефарозусковалентносвязаннымснейконканавалиномАфирма«»ШвецияаНАнеобладаеттакойспособностьюперсональноесообщениеРаботыисоавтатакжепоказаличтоуглеводныекомпонентыисущественноразличны

НейраминидазакакиНАадсорбируетсяколонкойсфитогемагглютининомвыделеннымизЭтотлектинчувствителенкприсутствиюглюкозыманнозыистерическиподобнымимостаткамСахаровИсследованиясиспользованиемлектиновдолжныпомочьвыяснитьлокализациюактивногоцентравмолекулеиполучитьинформациюоприродеееуглеводнойчасти

ИНГИБИТОРЫАКТИВНОСТИНЕЙРАМИНИДАЗЫ

ИнгИбированиеактивностиможновызватьнетолькоиспользуяантителаилилектиныноиспомощьюнекоторыхдругихвеществИнгибиторыактивностимогутбытькаксинтетическимитакиприродныминизкоиливысокомолекулярнымивысокоинизкоспецифичнымиИнтерескизучению ингибиторов   объясняется   тем    что они могут  быть

использованыкакхимиотерапевтическиесредствапротиввирусовсодержащих

ВеществаингибирующиеактивностьобычнонедействуютнаНАхотяобаэтихвирусныхбелкавзаимодействуютс«ейраминовойкислотойСиалиллактозарасщепляетсянонеявляетсяингибиторомгемагглютинацииОрозомукоидтакженеингибируетреакциюгемагглютинациихотяирасщепляетсяНейраминоваякислотаподавляетактивностьнонеподавляетгемагглютинации

ВработахибылонаказаночтополианионыоказываютзаметноеингибирующеедействиенавируснуюРибоидезоксирибонуклеиновыекислотысульфатдекстранамуцинподчелюстныхжелезсвиньиигепаринвконцентрацияхотдомкгмлподавляютактивностьвыделенныхизвирионовгриппаипарагриппаСинтетическиеинеорганическиеполианионытакиекактрипанкрасныйконгокрасныйатакжефосфовольфрамоваяижремниевольфрамоваякислотывконцентрацияхиМтакжеингибируютвирусовивирусовгриппаААктивностьэтихсоединенийоднаконеявляетсяспецифичнойпосколькуихингибирующеедействиеэлиминируетсямалымиколи•чествамиполикатионовтакимикакполилизин

СульфгидрмльныепрепаратытакиекактиогликолатглютатионцистеинмертиолатиингибируютактивностьвирусовгриппаштаммовАЯпонияихотяихконцентрациядляингибированиядолжнабытьдостаточновысокаинаходитсявпределахотдоМаВысокиеконцентрацииЭДТА —М  такжеоказывают ингибирующее

действие

БылопоказаночтобольшоеколичествоструктурнонесходныхсоединенийподавляетактивностьвирусовгриппаисоавтобнаружиличтопроизводныефенилглиоксаляипроизводныеоксамовыхкислотингибируютвирусагриппаААнглияСамыйэффективныйингибиторизэтойгруппысоединений—фенилоксамоваякислота—подавляетферментативнуюактивностьнавконцентрациях—МНесмотрянаточтопроизводныеоксамовыхкислотявляютсянеспецифическимиингибиторамивзаимодействующимисферментаминеимеющимиотношениякнейраминовойкислотенапримерслактатдегидрогеназойаминофенилоксамоваякислотасоединеннаяспомощьюковалентнойсвязиствердымматриксомбылауспешноиспользованадляочисткибактериальныхивирусныхНекоторыеизсоединенийописанныхисоавтоказываютслабоеантивирусноедействиенарепродукциюеирионовштаммаваллантоисныхмембранахнотеряютэтосвойствокогдавирусвыращиваетсянакуриныхэмбрионахисоавтописалидругойклассингибиторовкислыхявляющихсяпроизводнымиариламеркаптоакриловойкислотысмЭтиингибиторынаподавляютдействиевирусныхибактериальныхтакжеприотносительновысокихконцентрацияхМДругаягруппаингибиторовпроизводныеаминофенилбензоимидазоловинтереснывтомотношениичтоониявляютсяосновнымивотличиеотописанныхвышесоединенийвовсехмолекулахкоторыхсодержитсякарбоксильнаягруппаОднакобензоимидазольныепроизводныетакжеявляютсяотносительнослабымиингибиторамиактивности

ПроизводныедигидроитетрагидрохинолинаингибируютактивностьиявляютсяактивнымипротивогриппознымипрепаратамиПрепаратыбылиопробованынамышахилюдяхНедавноиустановиличтохотяисследованныеимидвапроизводныхизохинолинаинеингибируютдействиеоднакоихприсутствиемешаетопределениюактивностиспомощьютиобарбитуровойкислотыВсветеэтихданныхэкспериментыпроведенныеисоавтисоавтисоавттребуютдополнительнойпроверки

ПытаясьсоздатьспецифическиеингибиторынекоторыеисследователисинтезировалисоединенияявляющиесяструктурнымипроизводнымиацетилнейраминовойкислотыКакбылопоказаноранеесамаацетилнейраминоваяжислотаявляетсяслабымингибиторомвирусагриппаАСингапурсвеличинойКиМсравнимойсозначениемКмМдлясиалиллактозыАЯХорлинисоавтпоказаличтодезоксиянитрофенилтиоМацетилабнейрамйяоваякислотаакетозидацетилнейраминовойкислотыявляютсяконкурентнымиингибиторамисКиМпр«КмМдляацетилнейраминиллактозыДругойаналогнейраминовойкислоты—блактоназотридезоксиоксосарабинооктоновойкислотыдажеболееэффективенКиМдляподавленияактивностисмОбасоединенияобладалиингибирующейактивностьюпоотношениюковсемисследованнымвирусным

НедавнобылисинтезированыпроизводныедезоксинейраминовойкислотыобладающиеспособностьюспецифическиблокироватьактивностьКонкурентнымингибиторомявляетсядезоксидегидроацетилнейраминоваякислотаЭтовеществообладаетвысокимсродствомжбактериальномуферментуКиЫМиспособностьюподавлятьрепродукциюмиксовирусоввкультуретканиДезоксидигидроЫацетилнейраминоваякислотаотличаетсяотМацетилнейраминовойкислотытольконаличиемдвойнойсвязимеждумиматомамиуглеродаПроизводныеэтогосоединенияполучаемыепризамещенииацетильнойгруппынафлуородифлуоротрифлуороилихлорацетильнуюгруппуявляютсяещеболееэффективнымиингибиторамиВосемнадцатьпроизводныхэтоготипабылиисследованынаингибирующуюактивностьпротивразличныхвирусовгриппаНаиболееактивноепроизводное—дезоксидигидрогТрифлуороацетилнейраминоваякислотаФАНК—конкурентноингибируетактивностьвирусагриппасКиМТакимобразомФАНК—наиболееэффективныйизизвестныхингибиторовСродствовирусныхкнизкоивысокомолекулярнымсубстратампримернов

разнижечемкФАНКФАНКингибируетактивностьфермента«априконцентрацияхпорядка•—бМприконцентрациисубстратаМ«вероятноспецифичнадляиреакцийвкоторыхприсутствуетнейраминоваякислотаГематглютинациювирусовгриппатиповАиВФАНКнеингибируетновлияетнагемагглютинациювирусовпарагриппаивконцентрацияхвышеЮиМсоответственноПосколькутемнеменеегемагглютинирующуюактивностьвирусаСендайФАНКнеингибируетнельзяутверждатьчтоеесвойствоингибироватьгемагглютинациюуниверсальнодлявсехвирусовпарагриппа

НедавнобылопоказаночтоФАНКингибируетрепликациювирусагриппавкультуретканиФАНКподавляларепродукциювсехисследованныхвирусовгриппааОднакобылиобнаруженыразличиявчувствительностиразличныхштаммовкэтомуингибиторуВирусыимеющиевсвоемсоставетипавирусгриппаингибировалисьпотестууменьшенияразмерабляшекприконцентрацииФАНК—•вирусысодержащиетипа—рекомбинантХтребовалив—разболеевысокихконцентрацийФАНКдляполучениятойжестепениингибированияТочтовирусысодержащиеодинитотжетипНАиразныетипыпоразномуингибируютсяФАНКуказываетнаточтоантивирусноедействиеФАНКзаключаетсявспецифическомподавленииактивностиКрометогоэтуточкузренияподтверждаетиточтоФАНКневлияетнарепликациюдругихоболочечныхвирусовтакихкаквирускорииливирусвезикулярногостоматитанеимеющихвсвоемсоставе

РОЛЬНЕЙРАМИНИДАЗЫ

БолеечемзалетпрошедшихпослеоткрытияпоявилосьнесколькотеорийобъясняющихфункциюэтогоферментаввирионеНарядусвозможнойфизиологическойрольюзаключающейсявудалениинейраминовойкислотымуциновкоторыеявляютсяингибиторамипредполагалосьчтовпроцессерепликативногоциклаонаиграетопределеннуюрольлибоприпроникновениивирусав«леткулибопривысвобожденииизклеткивновьсинтезированноговирусаВпоследнеевремяпоявилисьданныеотомчтоосуществляетещеичетвертуюфункцию—предотвращаетагрегациюобразовавшихсявирусныхчастиц

НасамомраннемэтапеисследованийпредполагалосьчтоответственназапроникновениевирусагриппавчувствительныеклеткипослетогокаквирусприкрепилсякповерхностныммолекуламнейраминовойкислотыадляпроникновениявирионоввклеткунеобходимоотщеплениеэтойкислотыПротивэтойточкизренияимеетсянескольковозраженийВируссинактивированнойприпомощитепловойобработкипродолжаетпроникатьвклеткурепродуцируясьсовместносактивнымвирусомиучаствуявгенетическойрекомбинациисдругимивирусамиУдалениеспомощьюпротеолитическихферментовоказываловлияниенаинфекционностьштаммаПослеингибированияактивностиспомощьюингибитораФАНКприконцентрацииМкогдапроисходитпрактическиполноеподавлениеактивностиферментаненаблюдаетсяизменениепроникновениявирусавклеткунеопубликованныеданныеАнтителакневоздействуютнаинфекционностьвирусагриппаВсеэтифактысвидетельствуютотомчтоактивностьнесущественнанараннихэтапахрепликациивирусагриппаМожнооднакопредположитьчтоинактивацияилиудалениеспомощьютепловойобработкипротеолитическихферментовингибиторовилиантителвописанныхвышеопытахявляетсянеполнымичтоостаточнаяактивностьферментадостаточнадляосуществленияпервыхэтаповрепродукционногоцикла

предположилчтовоздействуетнаклеточныесубстратыиучаствуетвпроцессеотпочковываниявирусаотклеточнойповерхностиипришликтакомужезаключениюпоказавчтоодинизвариантоввирусагриппаобладающийнизкойактивностьюотпочковываетсяотклетоксоскоростьюменьшейчемуобычноговирусаштаммаУказанныйварианткрометогоимелболеенизкуюскоростьроставпроцессерепликацииВсветенедавнихэкспериментовсвариантамивирусагриппатипаАкоторыеразличаютсядруготдругапосодержаниюв—разможнопредполагатьчтокорреляцияактивностисоскоростьюростаивыходавирусаизклеткиможетопределятьсятипомклеткихозяина

ЕсливариантысвысокимсодержаниемреплицировалисьсболеевысокойскоростьювкуриныхэмбрионахихорионаллантюисныхмембранахтовариантыснизкимеесодержаниемреплицировалисьдоболеевысокоготитравкланеклетокСнеопубликованныеданные

Аргументвпользутогочтоучаствуетввысвобождениивирусаиз«леткиподтверждаетсяэкспериментамивкоторыхантинейраминидазныеантителаневлиялинаадсорбциювирусаноподавляливыходвновьсинтезированноговирусаизклеткиПредполагалосьчтоантителаПредотвращаютотщеплениеконцевыхнейраминовыхкислотитакимспособомблокируютотделениевирусныхчастицприкрепленныхкмолекулам«ейраминовойкислотынаклеточноймембранеЭтасхемабылаподтвержденаэкспериментамивкоторыхподавлениедесорбциивирусныхчастицвприсутствииантителчастичноснималосьспомощьюдобавленияизбыткабактериальнойисоавтнеподтвердилиэтирезультатыипоказаличтомоновалентныеантителаприсутствующиевовремяодногоцикларепликациивирусанеспособныблокироватьотделеневмрионовхотяиподавляютактивностьДругогородаэкспериментальныеданныетакжезаставляютусомнитьсявключевойроливовремядесорбциивирусаОдинаковоеколичествонейраминовойкислотыотщепляетсяотинфицированныхклетоквприсутствиииливотсутствиеантителкМаксимальноактивносинтезируетсязадолгодомоментаотпочковываниявируса

СовсемнедавноактивностьбивалентныхантителбылаобъясненанаосновеихнеантинейраминидазнойактивностиаспособностислужитьмостикамиилискрепкамимеждуотдельнымивирионамивпервыеэтопредположилиииприкреплятьвирусныеагрегатыкклеточнойповерхностиЕстественночтоэтосвойствоантителможетбытьнеединственныммеханизмомспомощьюкоторогоэтиантителаингибируютрепродукциювирусаВпротивовесэкспериментамисоавтспомощьюболеечувствительногометодаредукцииразмерабляшекпредполагающегоналичиемногоцикловойвируснойрепродукциибылопоказаночтоантителакингибируютрепликациювирусаВовремямногоцикловойрепликациидаженебольшоеуменьшениеурожаявирусаумножаетсязасчетповторениявкаждомпоследующемциклерепродукцииЭтирезультатыуказываютнаточтопокрайнеймеречастьингибирующейактивностиантителможноотнестизасчетспецифическогоингибированияЭкспериментысФАНК—низкомолекулярнымингибиторомописанныеранееподтверждаютточкузрениячтоингибированиеактивностивлияетнарепликациювирусовсодержащих

иуказываютнаточтоактивностьвсежесущественнадляпроцессарепликациивируса

НоваятеорияроливируснойзаключающейсявпредотвращениивируснойагрегациибылапредложенапослепроведенияэкспериментовстемпературочувствительнымимутантамивирусагриппаЭтиэкспериментыуказалиещеразнаважнуюрольферментавциклерепликациивирусагриппаисоавтизолировалимутантывирусагриппакаждыйизкоторыхпопадалводнуизнесколькихкомплементационныхгруппБылопоказаночтодваизэтихмутантовявляютсянейраминидазодефектнымиПринепермиссивныхтемпературахнейраминидазодефектныемутантыдаютчастицысодержащиенейраминовуюкислотувсвоейоболочкеиобразующиебольшиеагрегатыРанеебылопоказаночтооболочкачастицвирусагриппаиучасткиклеточныхмембрангдеотпочковываетсявируслишенынейраминовойкислотывероятнозасчетприсутствиявируснойБыловысказанопредположениечтоудалениенейраминовойкислотыможетбытьнеобходимымэтапомсборкивируснойчастицыРезультатыполученныеспомощьюнейраминидазодефектныхмутантовуказываютнаточтоморфологическиинтактныевирусныечастицыснейраминовойкислотойнаповерхностисвоейоболочкимогутотпочковыватьсяотклеткиноделаютэтоввидеагрегатованеиндивидуальныхвирионовВсвязистемчтовэтомслучаевирионыимеютсиаловуюкислотунасвоейповерхностиНАсоседнихвирусовмогут«принять»вирусныйчехолзарецепторискрепитьвирионыдругсдругомчтоприведеткобразованиюбольшихагрегатовИнтересныерезультатыбылиполученыприизученииэффектовсопровождающихискусственноеприкреплениесиаловойкислотыкповерхностивирусагриппаштаммаЭтапроцедуратакжеприводилакобразованиюнебольшихагрегатовсмглНаблюдаемоеприэтомувеличениеинфекционностивирусапослеприкреплениякегоповерхностисиаловойкислотыможнообъяснитьобъединениемнеинфекционныхвирионоввагрегатыпо—частицыТакойжефеноменописалии

ТеорияотакойфункциипредполагаетчтотолькотевирусыкоторыеимеютвсвоемсоставегемагглютининвзаимодействующийссиалосодержащимрецепторомклеточнойповерхноститеортоипарамиксовирусытребуютналичиянейраминидазыЭтимобъясняетсяпочемудругиеотпочковавшиесяотповерхностивирусынейраминидазынесодержатОсновываясьнадовольноограниченныхданныхможновероятноутверждатьчтотакиевирусыкакРНКсодержащиеонкогениыевирусывирусыСиндбисирабдовярусысодержат«асвоейповерхностинейраминовуюкислотуВключениенейраминовойкислотывоболочкувсехотпочковывающихсявирусовможетпроисходитьвпроцессеихсозреваниятолькоортоипарамиксовирусыдолжныудалятьсо

ПриизучениивирусовобладающихтемпературочувствительнойнейраминидазойспомощьюметодаэлектронноймикроскопиибылообнаруженочтоэтивирусыохотнееагрегируютдругсдругомчемадсорбируютсянарецепторахклеточныхмембрансодержащихнейраминовуюкислотуОдноизобъясненийуказанноговышефатаможетзаключатьсявтомчтововремяотпочкованиявирионынаходятсявоченьтесномконтактедругсдругомнаповерхностимембранипридесорбциисклеткиостаютсяприкрепленнымидруг«другуанепереходятнаповерхностьклеткиНаможновидетьфеноменагрегациинейраминидазодефектныхмутантныхвирусоврастущихпринепермиссивныхтемпературахПодобныйэффектможнонаблюдатьеслимутантвыращиваютприпермиссивныхтемпературахвприсутствииФАНКингибиторанейраминидазнойактивностиПриэтихусловияхдействиевируснойнейраминидазыподавляетсяавирионыимеютвсвоемсоставерецепторысодержащиенейраминовуюкислотучтоявляетсяпричинойихагрегации

КрометогофункциявируснойнейраминидазызаключаетсяочевидновотщепленииостатковнейраминовойкислотыотклеточныхмембранислоевмуциначтопредотвращаетреадсорбциювирусанаэтихрецепторахЭтотфактможетбытьособенноважнымвестественноминфекционномпроцессекогдавирусвзаимодействуетсослоямимуцинаилидругимиингибиторамигемагглютинацииНейраминидазажеможетнетолькодезагрегироватьвирусныечастицыноипредотвращатьихадсорбциюнаэтихгликопротеидахчтопозволяетвирионаминфицироватьновыечувствительныеклеткиТакимобразомнейраминидазаможетосуществлятьврепликативномцикленеоднуанесколькофункций